Ayios Nikolaos Rum Ortodoks Kilisesi; İstanbul Boğazı’nın Rumeli yakasında Karaköy ile Tophane arasında Mumhane Caddesi 45 numaralı parseldedir. Yapının doğusunda Karatavuk Sokağı, kuzeyde ise Hoca Tahsin Sokağı bulunur. Karaköy Ayios Nikolaos Kilisesi’nin tarihinin 16. Yüzyıla dayandığı ve mahallenin bu isimle anıldığı tarihi kayıtlarda bulunmaktadır. Sultan III. Murat dönemimde 1595 yılında çıkarılan bir fermanda Topkapı Sarayı’nda yapılacak bir tamirat için bu mahalleden Rum usta temin edilmiştir. 1583 yılında İstanbul Kiliseleri’nin listesini hazırlamış olan Karabeinikov listesinde bu yapı kayıtlıdır.
Kilise 1695 yılında yangında tahrip olmuş daha sonra 30 yılda onarılabilmiştir. !796 yılında bir daha yanmıştır. Yapıda bulunan kitabeye göre bugünkü yapı 1804 yılında yeniden inşa edilmiştir. Ayios Nikolaos isimli kiliseler denizcilere ithaf edilmiştir. Kapısının üzerindeki kitabede kilisenin daha fazla denizciler tarafından ziyaret edildiği ve 1834 yılında yenilendiği anlatılmaktadır. Yapı yüksek duvarlarla çevrili bir avlu içinde bulunmaktadır. Avlu duvarı, yapıya doğusunda apsis hizasında bitişiktir. Kilisenin batısında avlu duvarı ile arada kalan bölüm, neflerin hizasında kare kesitli duvar payeleri ve bunları bağlayan basık kemerlerle narteks olarak düzenlenmiştir. Narteks düzenlemesi, yapının kuzey ve güneyinin batı bölümünde çevreleyerek U biçiminde bir plan oluşturur. Dışta beşik çatı, içte düz tavan ile örtülü nartesks düzenlemesinin iki girişi kuzeyde ve güneyde bulunan dikdörtgen açıklıklardır.
Kilise bazilikal plan tipindedir. Üç nefli naos, doğusunda nefler hizasında içte yarım yuvarlak bir apsis ile sınırlanmıştır. Naosta nef ayırımı yedişer sütunun bulunduğu sıralar ile inşa edilmiştir. Yan nefler orta neften bir basamak daha yüksektir. Naosun zemini mermer kaplıdır. Kilisenin örtü sistemi, bağdadi tekniğindedir. Naosta orta nefin örtüsü yükseltilmiştir. Neflerin üstü basık tonozlarla geçilmiştir. Absisin örtüsü ise yarın kubbe halindedir.
